UniversitÓ degli Studi di Pavia - FacoltÓ di Scienze MMFFNN

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Biotecnologie Genetiche e Molecolari

Corsi di laurea:
Biotecnologie industriali
Docenti:
Ferretti Luca, Binda Claudia
Anno accademico:
2010/2011
Crediti formativi:
12
Ambiti:
BIO/18, BIO/11
Decreto Ministeriale:
270/04
Lingua di insegnamento:
Italiano

ModalitÓ

L'esame consiste in una prova orale sugli argomenti del programma completo dei due moduli.

Prerequisiti

Modulo Biotecnologie Molecolari - Binda

Conoscenze basilari di biochimica delle proteine.

Modulo Biotecnologie Genetiche - Prof. Luca Ferretti

Il modulo Ŕ strutturato in modo tale che sono richieste basi di Genetica, Biologia Molecolare, Biochimica e Chimica. In caso contrario non sarÓ possibile comprendere gli argomenti trattati durante la stragrande maggioranza delle lezioni.

Programma

Modulo Biotecnologie Molecolari - Binda

Struttura terziaria delle proteine; meccanismi di folding e ruolo delle chaperonine; proteine intrinsecamente non strutturate coinvolte in importanti processi cellulari. Bioinformatica: database e programmi interattivi per l’analisi della sequenza e della struttura delle proteine. Metodi per l’analisi strutturale delle proteine: spettroscopia NMR e cristallografia a raggi X (basi teoriche, tecniche sperimentali, applicazioni). Esempi di strutture di proteine e complessi proteici risolte con le due metodiche. Cenni su altri metodi (microscopia elettronica, SAXS, dinamica molecolare).

Modulo Biotecnologie Genetiche - Ferretti Luca

Introduzione e quadro di insieme delle tecnologie del DNA ricombinante. Sistemi di modificazione e restrizione propri e di tipo I, II e III. Le homing endonucleasi (Inteine). Saldatura di frammenti di DNA con ligasi e topoisomerasi. Principali metodiche per l’analisi e la visualizzazione del DNA: ibridazione per cenni; elettroforesi su gel di agarosio convenzionale e elettroforesi a campi pulsati (PFGE). Sintesi chimica di DNA. Sequenziamento di DNA: dideossi e high throughput sequencing: i tre sistemi principali, 454 pyrosequencing (Roche), Solexa (Illumina) e SOLiD? (Applied Biosystems). PCR, principi e utilizzi (cDNA, genoteche, EST, mutagenesi, sequencing).
Il concetto di vettore e lo sviluppo dei sistemi vettore/ospite. Vettori per la costruzione di genoteche e tipologie di genoteche. Plasmidi, fasmidi, fago lambda, cosmidi, BAC, PAC e YAC. Problematiche della costruzione di genoteche e metodi per l’analisi e la selezione di cloni: selezioni per marcatori, per fenotipo (es. lacZ) e selezione positiva dei ricombinanti (es. sacB, ccd). Vettori e sistemi di espressione di proteine ricombinanti. Esempi di vettori di espressione: la serie pET con promotori T7, la serie pTRC con his tag. Problematiche per la produzione ottimale di proteine in sistemi eterologhi. Metodi per l’espressione e la purificazione di prodotti ricombinanti in E. coli. Purificazione per affinitÓ (vari tipi di tag), da corpi inclusi con refolding in vitro, mediante secrezione. Sistemi di espressione in lievito, funghi filamentosi e in cellule d’insetto (Baculovirus e Bacmidi). Sistemi di espressione in cellule coltivate di mammifero. Sistemi a due ibridi per lo studio delle interazioni tra proteine. Tecniche per la mutagenesi sito-specifica: M13, fasmidi, mutagenesi in plasmidi mediante PCR, mutagenesi con fosforotioati, mutagenesi con tRNA soppressori, mutagenesi a cassetta con miscele di oligonucleotici sintetici. Protein engineering, principi e campi di applicazione. Esempi di proteine modificate per utilizzi in biotecnologie e in campo biomedico. Animali transgenici. Le tecniche per modificare geneticamente animali. Sviluppo delle tecniche di transgenesi nel topo. Retrovirus, vettori lentivirali, microiniezione e cellule ES. Targeting mediante ricombinanzione omologa e con ricombinazione sito specifica (Cre/loxP). Transgeni ad attivazione condizionale (sistemi tetOn tetOFF). Gli animali da reddito transgenici e la clonazione. Esempi di applicazione di animali transgenici nelle biotecnologie. Modelli di malattie umane, xenotrapianti, bioreattori animali.

Bibliografia

Molecular Biotechnology. Principles and Applications of Recombinant DNA 4th edition 2010. Glyck BR, Pasternak JJ, Pattern CL. ASM Press, Washington.


Moduli

Modulo:
Biotecnologie Genetiche
Docente:
Ferretti Luca
Crediti formativi:
6
Ambito:
BIO/18

Programma

Introduzione e quadro di insieme delle tecnologie del DNA ricombinante. Sistemi di modificazione e restrizione propri e di tipo I, II e III. Le homing endonucleasi (Inteine). Saldatura di frammenti di DNA con ligasi e topoisomerasi. Principali metodiche per l’analisi e la visualizzazione del DNA: ibridazione per cenni; elettroforesi su gel di agarosio convenzionale e elettroforesi a campi pulsati (PFGE). Sintesi chimica di DNA. Sequenziamento di DNA: dideossi e high throughput sequencing: i tre sistemi principali, 454 pyrosequencing (Roche), Solexa (Illumina) e SOLiD? (Applied Biosystems). PCR, principi e utilizzi (cDNA, genoteche, EST, mutagenesi, sequencing).
Il concetto di vettore e lo sviluppo dei sistemi vettore/ospite. Vettori per la costruzione di genoteche e tipologie di genoteche. Plasmidi, fasmidi, fago lambda, cosmidi, BAC, PAC e YAC. Problematiche della costruzione di genoteche e metodi per l’analisi e la selezione di cloni: selezioni per marcatori, per fenotipo (es. lacZ) e selezione positiva dei ricombinanti (es. sacB, ccd). Vettori e sistemi di espressione di proteine ricombinanti. Esempi di vettori di espressione: la serie pET con promotori T7, la serie pTRC con his tag. Problematiche per la produzione ottimale di proteine in sistemi eterologhi. Metodi per l’espressione e la purificazione di prodotti ricombinanti in E. coli. Purificazione per affinitÓ (vari tipi di tag), da corpi inclusi con refolding in vitro, mediante secrezione. Sistemi di espressione in lievito, funghi filamentosi e in cellule d’insetto (Baculovirus e Bacmidi). Sistemi di espressione in cellule coltivate di mammifero. Sistemi a due ibridi per lo studio delle interazioni tra proteine. Tecniche per la mutagenesi sito-specifica: M13, fasmidi, mutagenesi in plasmidi mediante PCR, mutagenesi con fosforotioati, mutagenesi con tRNA soppressori, mutagenesi a cassetta con miscele di oligonucleotici sintetici. Protein engineering, principi e campi di applicazione. Esempi di proteine modificate per utilizzi in biotecnologie e in campo biomedico. Animali transgenici. Le tecniche per modificare geneticamente animali. Sviluppo delle tecniche di transgenesi nel topo. Retrovirus, vettori lentivirali, microiniezione e cellule ES. Targeting mediante ricombinanzione omologa e con ricombinazione sito specifica (Cre/loxP). Transgeni ad attivazione condizionale (sistemi tetOn tetOFF). Gli animali da reddito transgenici e la clonazione. Esempi di applicazione di animali transgenici nelle biotecnologie. Modelli di malattie umane, xenotrapianti, bioreattori animali.

Bibliografia

Molecular Biotechnology. Principles and Applications of Recombinant DNA 4th edition 2010. Glyck BR, Pasternak JJ, Pattern CL. ASM Press, Washington.


Modulo:
Biotecnologie Molecolari
Docente:
Binda Claudia
Crediti formativi:
6
Ambito:
BIO/11

Programma

Struttura terziaria delle proteine e interazioni deboli alla base dell’avvolgimento specifico di una proteina. Il problema del folding e gli esperimenti di Anfinsen. Il paradosso di Levinthal. Il folding funnel e gli intermedi di folding. I modelli finora sviluppati per il meccanismo di folding. Ruolo delle chaperonine nel processo di folding: Hsp70 e Hsp60 (il complesso GroEL?-GroES). Casi pi¨ complessi di folding: proteine eucariotiche, proteine di membrana, proteine intrinsecamente non strutturate.
Bioinformatica: database e siti web per la gestione dei dati biologici. NCBI e EBI. Analisi e allineamenti di sequenza di proteina: BLAST, PSI-search, FAST, CLUSTALW. InterPro? per l’analisi integrata di proteine. Famiglie, domini, patterns e fingerprints. Strumenti bioinformatici per i casi particolari: IUPred e RONN per proteine/domini non strutturati, hydropathy plots per le proteine di membrana. Database per le strutture delle macromolecole: il Protein Data Bank (PDB). Allineamenti di struttura (SSM). Predizione della funzione in base alla struttura: ProFunc?. Bioinformatica di piccole molecole: ChEBI?.
Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) per lo studio della struttura tridimensionale delle proteine. Il momento magnetico nucleare di spin. I due stati di spin del protone e i livelli di energia all’interno di un campo magnetico esterno. ProprietÓ di assorbire radiofrequenze: la frequenza di Larmor e le condizioni di risonanza. Il chemical shift. L’accoppiamento di spin. Rilassamento, FID e spettro NMR 1-D. Sviluppo di NMR multidimensionale per lo studio della struttura tridimensionale delle proteine: COSY e NOESY. Assegnazione delle risonanze negli spettri NMR e ricostruzione della struttura. Esempi di strutture di proteine risolte con la tecnica NMR.
Cristallografia a raggi X per lo studio della struttura tridimensionale delle proteine. Biocristallografia: un “microscopio” a raggi X. Cristalli di proteina e il fenomeno della diffrazione dei raggi X. Diagramma di fase di una proteina. Metodologia per cristallizzare una proteina: agenti precipitanti, tecniche di cristallizzazione, screening di condizioni. Cristalli: reticolo cristallino, cella elementare e parametri di cella. Operatori di simmetria, gruppi puntuali e gruppi spaziali. UnitÓ asimmetrica, simmetria cristallografica e non-cristallografica. MolteplicitÓ e coefficiente di Matthew. Esperimento di diffrazione dei raggi X da parte di un cristallo di proteina: sorgente di raggi X, montaggio del cristallo sulla testina goniometrica, detector per misurare le immagini di diffrazione. Teoria della diffrazione: i piani reticolari e gli indici di Miller. La legge di Bragg. Il reticolo reciproco. La sfera di Ewald. I riflessi e gli spot sull’immagine di diffrazione. La mosaicitÓ. Il fattore di scattering di un atomo. Rappresentazione vettoriale di un’onda. Ampiezza e fase dei raggi diffratti e fattori di struttura. La mappa della densitÓ elettronica e la trasformata di Fourier. La legge di Friedel. Il problema della fase. La funzione Patterson. Metodi per risolvere il problema della fase: sostituzione molecolare, sostituzione isomorfa (atomi pesanti, ambiguitÓ di fase, sezioni di Harker), dispersione anomala. Metodi per migliorare le fasi. Il file delle coordinate della struttura. Fitting della catena polipeptidica nella mappa della densitÓ elettronica. Raffinamento della struttura e R-factor. Processamento dei dati di diffrazione. Confronto NMR e cristallografia a raggi X. Il Protein Data Bank (PDB). I modi grafici per rappresentare la struttura tridimensionale delle proteine. Esempi di strutture risolte con la cristallografia a raggi X.
Microscopia elettronica: TEM e SEM; Cryo-EM; Preparazione del campione e colorazione negativa; single-particle EM, ricostruzione 3D dalle proiezioni 2D. Small-angle X-ray scattering (SAXS): principi di base e applicazioni. Molecular dynamics: principi di base e applicazioni.

Bibliografia

Libro adottato: “Physical Biochemistry: principles and applications”, David Sheehan, Wiley-Blackwell – 2nd edition.
Articoli di riviste scientifiche come esempi delle tecniche spiegate.


Elenco appelli e prove

Nessuna prova presente

Credits: apnetwork.it