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Tecniche genetiche e biotecnologie molecolari

Corsi di laurea:
Biotecnologie
Docenti:
Ferretti Luca
Anno accademico:
2009/2010
Crediti formativi:
6
Ambito:
BIO/18
Decreto Ministeriale:
509/99
Lingua di insegnamento:
Italiano

Modalità

La prova di esame è un colloquio orale con domande su tutti gli argomenti trattati durante il corso.

Prerequisiti

Considerati i contenuti del corso si presuppone che gli studenti abbiano già sostenuto gli esami di Genetica, Biologia Molecolare e Biochimica. Vicerversa non saranno in grado di comprendere adeguatamente gli argomenti trattati in questo corso.

Programma

Introduzione e quadro di insieme delle tecnologie del DNA ricombinante. Sistemi di modificazione e restrizione propri e di tipo I, II e III. Le homing endonucleasi (Inteine). Saldatura di frammenti di DNA con ligasi e topoisomerasi. Principali metodiche per l’analisi e la visualizzazione del DNA: ibridazione per cenni; elettroforesi su gel di agarosio convenzionale e elettroforesi a campi pulsati (PFGE). Sintesi chimica di DNA. Sequenziamento di DNA: dideossi e high throughput sequencing: i tre sistemi principali, 454 pyrosequencing (Roche), Solexa (Illumina) e SOLiD? (Applied Biosystems). PCR, principi e utilizzi (cDNA, genoteche, EST, mutagenesi, sequencing).
Il concetto di vettore e lo sviluppo dei sistemi vettore/ospite. Vettori per la costruzione di genoteche e tipologie di genoteche. Plasmidi, fasmidi, fago lambda, cosmidi, BAC, PAC e YAC. Problematiche della costruzione di genoteche e metodi per l’analisi e la selezione di cloni: selezioni per marcatori, per fenotipo (es. lacZ) e selezione positiva dei ricombinanti (es. sacB, ccd). Vettori e sistemi di espressione di proteine ricombinanti. Esempi di vettori di espressione: la serie pET con promotori T7, la serie pTRC con his tag. Problematiche per la produzione ottimale di proteine in sistemi eterologhi. Metodi per l’espressione e la purificazione di prodotti ricombinanti in E. coli. Purificazione per affinità (vari tipi di tag), da corpi inclusi con refolding in vitro, mediante secrezione. Sistemi di espressione in lievito, funghi filamentosi e in cellule d’insetto (Baculovirus e Bacmidi). Sistemi di espressione in cellule coltivate di mammifero. Sistemi a due ibridi per lo studio delle interazioni tra proteine. Tecniche per la mutagenesi sito-specifica: M13, fasmidi, mutagenesi in plasmidi mediante PCR, mutagenesi con fosforotioati, mutagenesi con tRNA soppressori, mutagenesi a cassetta con miscele di oligonucleotici sintetici. Protein engineering, principi e campi di applicazione. Esempi di proteine modificate per utilizzi in biotecnologie e in campo biomedico. Animali transgenici. Le tecniche per modificare geneticamente animali. Sviluppo delle tecniche di transgenesi nel topo. Retrovirus, vettori lentivirali, microiniezione e cellule ES. Targeting mediante ricombinanzione omologa e con ricombinazione sito specifica (Cre/loxP). Transgeni ad attivazione condizionale (sistemi tetOn tetOFF). Gli animali da reddito transgenici e la clonazione. Esempi di applicazione di animali transgenici nelle biotecnologie. Modelli di malattie umane, xenotrapianti, bioreattori animali.

Bibliografia

BIBLIOGRAFIA

Molecular Biotechnology. Principles and Applications of Recombinant DNA 4th edition 2010. Glyck BR, Pasternak JJ, Pattern CL. ASM Press, Washington.


Elenco appelli e prove

Nessuna prova presente

Credits: apnetwork.it